بررسی نقش توالی های v و vi در تعیین خانواده آنزیمی آلفا آمیلازهای حدواسط

آنزیم های آمیلاز حد واسط ( اغلب در زیر خانواده gh13-36 دسته بندی شده اند) که دارای توالی mpdln در ناحیه حفظ شده پنجم می باشند با مخلوطی از ویژگی های آنزیمی آلفا آمیلاز و زیر خانواده های آنزیمی الیگو-6،1-گلوکزیداز و نئوپلولاناز (مثل هیدرولیز سیکلودکسترین یا ترانس گلیکوزیلاسیون) شناخته می شوند. از آنجا که این آنزیم ها می توانند بر رنج وسیعی از سوبستراها اثر کنند دارای کاربردهای وسیعی در صنایع نشاسته هستند. آنزیم bmw آمیلاز پیش از این به دلیل توانایی اش در هیدرولیز پلولان و نشاسته از باکتری باسیلوس who جدا شده و با توجه به توالی ناحیه حفظ شده پنجم جزو آنزیم های گروه حد واسط قرار گرفته بود. با بررسی فعالیت آنزیم مشخص شد که آنزیم توانایی هیدرولیز نشاسته، آمیلوز، آمیلوپکتین،پلولان و سیکلودکسترین را دارد. کارایی کاتالیتیکی آنزیم برای سوبستراهای نشاسته، آمیلوز و آمیلوپکتین تقریباً 5/5 برابر بیشتر از پلولان بدست آمد. بررسی های hplc نشان داد که آنزیم منحصر به فرد bmw آمیلاز از هیدرولیز تمام سوبستراهای فوق گلوکز را به عنوان محصول اصلی و عمده تولید می کند. از طرفی آنزیم توانایی تولید گلوکز از مالتوز را طی فرآیند ترانس گلیکوزیلاسیون دارد. آنالیز hplc نشان داد که bmw- آمیلاز یک آنزیم حد واسط جدید است که از هیدرولیز سوبستراهای فوق فقط گلوکز ایجاد می کند. در ناحیه حفظ شده ششم (83-qvngiwmmp) همانند زیر خانواده الیگو-6،1- گلوکزیدازها، یک اسید آمینه تریپتوفان بسیار حفظ شده وجود دارد که در زیر خانواده نئوپلولانازها با اسید آمینه تایروزین جایگزین شده است. در این مطالعه به منظور بررسی نقش این اسید آمینه در ویژگی سوبسترایی آنزیم جهش w88y انجام شد. ویژگی سوبسترایی آنزیم برای سوبستراهای نشاسته، پلولان، آمیلوز و آمیلوپکتین تعیین شد. پایداری حرارتی و کارآیی کاتالیتیک آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم وحشی افزایش پیدا کردند در حالی که تغییری در محصول ایجاد شده بوجود نیامد. همانطور که انتظار می رفت فعالیت نئوپلولانازی آنزیم افزایش یافت. توالی کوتاه qpdln، mpkln، mpdln در ناحیه حفظ شده پنجم به ترتیب به عنوان تعیین کننده زیر خانواده های الیگو-6،1- گلوکزیداز، نئوپلولاناز و زیر خانواده آنزیم های حد واسط به کار می رود. توالی ناحیه حفظ شده پنجم در مورد bmw- آمیلاز به صورت 201-mpdln است. ارتباط بین این توالی و ویژگی سوبسترایی آنزیم نیز بررسی شد. آسپارتات 203 با استفاده از روش sdm به لیزین، گلوتامات، والین و آلانین تبدیل شد. جهش های d203a و d203v باعث غیر فعال شدن آنزیم شدند. جهش یافته های d203e و d203k توانایی هیدرولیز پلولان را از دست دادند در حالی که همچنان بر سایر سوبستراها اثر می کردند. بررسی محصولات تولید شده با tlc نشان داد که تغییری در محصول تولیدی ایجاد نشد. در ادامه به منظور بررسی نقش هم زمان جهش در دو ناحیه پنجم و ششم، جهش های دوتایی انجام شد. جهش یافته های d203a، w88y و d203v و w88y همچنان غیر فعال بودند در حالی که جهش یافته های d203k، w88y و d203e، w88y توانایی هیدرولیز پلولان را مجدداً بدست آوردند. در مورد این جهش ها نیز همچنان گلوکز به عنوان محصول اصلی تولید می شد.